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Item Aplicação das técnicas de PCR, micronúcleo e espectroscopia FT-IR no diagnóstico do HPV na prevenção do câncer cervical(2020-02-28) Canevari, Renata de Azevedo; Soares, Luís Eduardo Silva; Castilho, Maiara Lima; Batista, Nelson Jorge Carvalho; Koga-ito, Cristiane Yumi; Viana, Magda Rogéria Pereira; Raniero, Leandro José; São José dos CamposO câncer de colo de útero é considerado o terceiro tumor mais frequente e a segunda causa de mortalidade de mulheres no Brasil, sendo considerado um problema de saúde pública. A infecção pelo Papilomavírus Humano (HPV) é um dos principais fatores de risco que contribui para o desenvolvimento desta neoplasia. O principal método para o diagnóstico é a análise citológica pelo exame de Papanicolaou, mas a alta taxa de casos falso-negativos inviabiliza uma avaliação adequada, sendo importante o uso de técnicas auxiliares de detecção do HPV e, consequentemente, no diagnóstico desta doença. Este estudo teve como objetivo avaliar a eficácia, aplicabilidade, sensibilidade e especificidade dos métodos alternativos para a detecção do HPV na prevenção do câncer cervical. As técnicas MN e FT-IR são indiretas, mas podem fornecer resultados úteis na detecção do HPV em pacientes submetidas ao exame citopatológico. As amostras de fluido cervical foram obtidas de 50 pacientes com citológica normal, posteriormente analisada pela PCR, teste de MN e análise de FT-IR. A análise molecular consistiu de extração do DNA das amostras endocervicais pelo protocolo QIAamp® Virus Spin kit (Qiagen), seguida da realização da PCR do gene viral L1 utilizandose os iniciadores MY09 e MY11. As amostras foram divididas com base nos resultados da PCR em dois grupos, HPV positivo (sete amostras) e HPV negativo (43 amostras). As análises dos testes de MN das amostras ectocervicais foram realizadas pelas leituras das frequências absoluta (N) e relativa (%), obtidas as médias, desvios padrões e analisadas pelos testes Shapiro-Wilk, Mann-Whitney e Qui-quadrado (X2). As análises de FT-IR das amostras endocervicais foram realizadas no equipamento Spectrum 400. A partir da matriz de covariância foram obtidos os componentes principais (PCs), e por meio das análises discriminantes linear e quadrática, supervisionada pelos resultados da PCR (grupos HPVpositivo e HPV negativo), foram calculados os valores de sensibilidade e especificidade. Os resultados das análises de PCR das 50 amostras permitiram validar 43 exames citológicos, mas sete amostras de resultado citológico negativo estavam infectadas pelo HPV. Os testes de MN mostraram maiores frequências de MN em amostras com HPV positivo, fatores relacionados a idade, ao abortamento e o uso de bebidas alcoólicas. Os espectros de análise FT-IR mostraram variações nas bandas de DNA e proteínas em amostras com alta frequência de MN, provavelmente devido à presença de histonas nucleossômicas e DNA que formam o MN. A análise dos componentes principais dos espectros de FT-IR não foi capaz de separar eficientemente as amostras HPV positivas das HPV negativas, mostrando-se inespecífico para diagnosticar o vírus. Assim, com a realização do estudo observou-se que a técnica de PCR pode ser considerada padrão ouro para a detecção do HPV por sua alta sensibilidade, que o aumento da frequência de MN observado neste estudo em amostras infectadas pelo HPV, pode ser devido à instabilidade genômica, causada pela presença do vírus, e que, apesar da espectroscopia FT-IR apresentar grande potencial, por ser um teste de alta sensibilidade e especificidade no rastreamento do câncer cervical, neste estudo não demonstrou ser eficiente na discriminação de amostras infectadas pelo HPV. Dessa forma, enfatiza-se que, estudos adicionais devem ser conduzidos para a aplicação da espectroscopia FT-IR e o teste de MN no diagnóstico da infecção pelo HPV e consequente aplicação na prevenção de câncer cervical.Item PCR-RFLP and FTIR-based detection of high-risk human papilloma virus for cervical cancer screening and prevention(Elsevier) Melo, Igor Martins Alves; Viana, Magda Rogéria Pereira; Pupin, Breno; Bhattacharjee, Tanmoy Tapobrata; Canevari, Renata de AzevedoBackground: Approximately 70% of cervical carcinoma cases show the presence of high-risk Human Papilloma Virus (HPV), especially HPV-16 and HPV-18, and can be used to stratify high risk patients from low risk and healthy. Currently, molecular biology techniques such as polymerase chain reaction (PCR) are used to identify the presence of virus in patient samples. While the methodology is highly sensitive, it is labor intensive and timeconsuming. Alternative techniques, such as vibrational spectroscopy, has been suggested as a possible rapid alternative. Therefore, in this study, we evaluate the efficiency of cervical fluid Fourier Transform Infrared spectroscopy (FTIR) in patient risk stratification informed by PCR. Methods: Cervical fluid samples (n = 91) were obtained from patients who have undergone routine Papanicolaou (Pap) test. Viral genome was identified and classified as high/low-risk by PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP). FTIR spectra were acquired from samples identified by PCR-RFLP as No-HPV (n = 10), high-risk HPV (n = 7), and low-risk HPV (n = 7). Results: Of the 91 samples, was detected the viral genome by PCR in 36 samples. Of these 36 samples, nine samples were identified to contain high-risk HPV (HR-HPV) and nine samples were found to have low-risk HPV (LR-HPV). The FTIR spectra acquired from No-HPV, LR-HPV, and HR-HPV showed differences in 1069, 1437, 1555, 1647, 2840, 2919, and 3287 cm-1 bands. Principal Component Analysis (PCA) showed distinct clusters for No-HPV and HR-HPV and No-HPV and LR-HPV, but there was significant overlap in the clusters of HR-HPV and LR-HPV. PCA-Linear Discriminant Analysis (PC-LDA) after Leave One Out Cross Validation (LOOCV) classified No-HPV from HR-HPV and No-HPV from LR-HPV with 100% efficiency in the 1400-1800 cm-1 spectral range. LOOCV classifications for LR-HPV and HR-HPV from each other were 71 and 75%, respectively, in the 2800-3400 cm-1 spectral range. Conclusions: The results highlight the high sensitivity of PCR-RFLP in HPV identification and show that FTIR can classify samples identified as healthy, low, and high-risk samples by PCR-RFLP. General significance: We show the possibility of using FTIR for initial cervical cancer risk stratification followed by detailed PCR-RFLP investigations for suspect cases.