Dissertação-PPGEB

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Ação da Terapia Fotodinâmica em linhagem celular de gliossarcoma 9L/lacZ utilizando baixas fluências e concentrações de Fotoenticine e Photodithazine
(2022-03-22) Ferreira-Strixino, Juliana; Soares, Cristina Pacheco; Castilho, Maiara Lima; Tada, Dayane Batista; Vitório, Gabrielle dos Santos; Pinto, Juliana Guerra; São José dos Campos
O Gliossarcoma é um câncer agressivo, com alta propensão metastática. Atualmente seu tratamento consiste em ressecção cirúrgica seguida de radio-quimioterapia, oferecendo baixa expectativa e qualidade de vida. Como proposta alternativa, a Terapia Fotodinâmica (TFD) se apresenta como método seletivo de tratamento, combinando o uso de um fotossensibilizador (FS), oxigênio molecular e luz. Esses três elementos geram as espécies reativas de oxigênio, levando à morte celular. O objetivo desse estudo foi avaliar a ação da TFD utilizando as clorinas Fotoenticine (FTC) e Photodithazine (PDZ) em baixas concentrações e fluências, verificando a diferença entre seus efeitos. Foram utilizadas células 9L/lacZ e concentrações de 1,55 µg.mL -12,50 µg.mL -1 e 50,00 µg.mL-1de ambas clorinas. As células foram irradiadas com um dispositivo a base de LED em 660 nm nas fluências de 1 J/cm², 5 J/cm² e 10 J/cm², em 25 mW/cm². Observou-se que ambas clorinas apresentam indícios da formação de fotoprodutos após irradiação e são internalizadas em toda extensão citoplasmática, com restrição ao núcleo. Os testes de citotoxicidade demonstraram redução >98% da viabilidade celular e queda na atividade mitocondrial >86% nas concentrações de 50,00 µg.mL-1 e 12,50 µg.mL-1 em todas as fluências de luz testadas, entretanto a concentração de 1,55 µg.mL-1não apresentou um resultado tão eficaz na fluência de 1 J/cm². Houve alteração na adesão celular após TFD conforme diminuição da concentração, no qual as células desprendidas se apresentavam mortas, indicando que o desprendimento celular corresponde à uma característica do processo de morte celular, assim como as alterações morfológicas apresentadas, como a perda da extensão citoplasmática, adquirindo formato arredondado. A imunodetecção de HSP70 diminuiu, enquanto a de HSP27 aumentou após TFD com o FTC. Com isso, conclui-se que ambos FS foram eficazes na TFD em células de gliossarcoma, com destaque para a concentração de 50,00 µg.mL-1 na fluência de 5 J/cm². Além disso, levando em consideração a elevada imunodetecção da HSP27 na TFD com o FTC, o PDZ se apresenta como um promissor FS para ser empregado na TFD com células 9L/lacZ, encorajando estudos in vivo.
Avaliação in vitro de nanopartículas de ouro em células de GBM irradiadas em aparelhos de tomografia e radioterapia
(2020-07-23) Raniero, Leandro José; Soares, Cristina Pacheco; Liu, Andréa Santos; Gialluca, Vanessa Dias; Castilho, Maiara Lima; São José dos Campos
s neoplasias malignas representam um grupo de mais de 100 doenças diferentes que apresentam como característica, a diferenciação genética do tecido de origem, levando ao crescimento desordenado de células, que invadem tecidos e órgãos normais. Embora tenham ocorrido avanços significativos dessas modalidades tradicionais terapêuticas, as neoplasias malignas representam ainda um grande desafio, considerando, especialmente os subtipos de maior agressividade e letalidade. Entre os tumores mais agressivos encontramos o Glioblastoma Multiforme, com mortalidade de cerca de 95% e sobrevida mediana de 15 meses. A Temozolomida é o quimioterápico até o momento testado e aprovado com melhor resposta neste subtipo tumoral. O objetivo desta dissertação foi avaliar a potencialização desta modalidade terapêutica associada as nanopartículas de ouro quando irradiadas com radioterapia e tomografia. Para tanto a Temozolomida foi caracterizada quimicamente, realizada a sintetização de nanopartículas de ouro e, posteriormente foi testada a citotoxidade isolada do quimioterápico e dos conjuntos da Temozolomida com as nanopartículas de ouro em diferentes concentrações e, por fim foi avaliado a potencialização dos efeitos citotóxicos em placas irradiadas em aparelho de tomografia e radioterapia. Os resultados demonstram que houve um efeito citotóxico quando as nanopartículas de ouro foram utilizadas isoladamente e em conjunto com a Temozolomida e irradiadas com aparelho de tomografia e as nanopartículas de ouro potencializaram significativamente o efeito citotóxico da radioterapia quando associado a Temozolomida. Conclui-se, portanto que as nanopartículas de ouro potencializam o efeito da Temozolomida no tratamento de células de GBM, tanto quando irradiado com tomografia, quanto com radioterapia, com grande potencial para uso terapêutico em associação com as terapias tradicionais.
Estudo da terapia fotodinâmica utilizando alumínio ftalocianina tetrasulfonada: uma análise química, física e biológica dos componentes terapêuticos
(2020-02-05) Soares, Cristina Pacheco; Castilho, Maiara Lima; Vasconcellos, Luana Marotta Reis de; Godoi, Bruno Henrique; Ferreira-Strixino, Juliana; São José dos Campos
A terapia fotodinâmica (TFD) é uma técnica descoberta no início do século XX, que utiliza a luz como catalisador de uma reação de oxidação no órgão, tecido ou célula alvo. Para que ocorra a reação fotodinâmica é necessário oxigênio ao nível molecular, fotossensibilizante e uma fonte de luz. A técnica é utilizada em inúmeros tratamentos estéticos e dermatológicos sendo atualmente empregue como tratamento antimicrobiano e antifúngico, em infecções virais causadas pelos vírus Herpes e Papilloma, além de patologias como periodontite, tratamento de leishmaniose cutânea e alguns casos de câncer. Contudo, um dos obstáculos no emprego da técnica como tratamento contínuo ou de longa duração para doenças de alta complexidade, é o possível mecanismo de resistência às drogas, que as células podem apresentar quando são expostas ao fármaco fotossensibilizante por sucessivas vezes ou longos períodos, há ainda a divergência dos métodos aplicados em estudos e procedimentos clínicos, resultando assim em respostas variadas e fragilidade nos resultados divulgados, acarretando inúmeros questionamentos sobre a sua aplicabilidade nos procedimentos clínicos. O presente estudo tem por finalidade avaliar a capacidade de sobrevivência de células da linhagem HEp-2 após a TFD e evidenciar critérios para elaboração de um guia de boas práticas para aplicação da TFD utilizando o fotossensibilizante de segunda geração AlPcS4. Assim utilizando análises espectroscópicas e testes colorimétricos foi possível delinear a concentração de trabalho do fotossensibilizante de 5 µM em conjunto da densidade mínima de energia necessária para ativa-lo de 5 J/cm². Após determinar os parâmetros para os testes, utilizou-se os ensaios colorimétricos e imunológicos em conjunto com a quantificação gênica das HSP’s e da enzima SOD2, e para avaliara a resposta biológica pós a TFD. Os resultados dos ensaios colorimétrico, coloração de cristal violeta, coloração de vermelho neutro e conversão do sal de MTT, demonstram uma redução na viabilidade celular após a TFD consolidando a escolha dos parâmetros de concentração do fotossensibilizante e dose de energia. Já a avaliação imunológica das citocinas IL-6 e TNF – a não permitiu uma conclusão clara sobre o ambiente tumoral pós a TFD devido ao baixo poder de correlação entre os resultados obtidos. Por fim a expressão genica demonstrou redução significativa dos genes das HSP’s, glicoproteínas e enzima SOD2, evidenciando um potencial destrutivo da TFD, sugerindo que o tratamento uma vez padronizado não pode gerar clones resistentes a terapia, assegurando assim sua eficácia utilizando a linhagem celular HEp-2 como objeto de estudo. Acredita-se que este estudo fornece critérios para implantação de práticas mais eficientes utilizando a terapia fotodinâmica.
Nanopartículas de ouro funcionalizadas aos complexos de Gadolínio e EGF para detecção precoce do câncer de mama
(2021-04-09) Castilho, Maiara Lima; Ferreira-Strixino, Juliana; Liu, Andréa Santos; Queiroz, Suélio Marinho de; Raniero, Leandro José; São José dos Campos
O câncer pode ser definido como doença heterogênea vinculada a fatores ambientais, estilo de vida e mutações, representando a segunda causa de morte no Brasil e no Mundo. Dentre os diferentes tipos, destaca-se o câncer de mama, visto ser a maior causa de morte que acometem mulheres, sendo considerado um problema de saúde pública. O carcinoma mamário exibe diferentes vias de sinalização para a sobrevivência, crescimento e tratamento. O subtipo basalóide representa aproximadamente 20% dos casos de carcinoma mamário, sendo conhecido como triplo negativo por apresentar a ausência da expressão de receptores de estrogênio, progesterona e do fator de crescimento epidérmico 2, e superexpressão do receptor do fator de crescimento epidérmico. Essas características podem ser associadas ao difícil diagnóstico e pior prognóstico. Neste contexto, o diagnóstico precoce destes tipos de câncer oferece uma possível solução para essa problemática. Assim, a ressonância magnética (RM) associada ao uso de substâncias paramagnéticas, conhecidas como os agentes de contraste, entre eles o Gadolínio (Gd) podem ser utilizados como um método alternativo para o diagnóstico precoce. Embora a RM possua uma alta sensibilidade, esta técnica apresenta baixa especificidade que podem ser superadas com o uso das nanopartículas de ouro, que se destacam como uma opção promissora para diagnóstico direcionado, visto permitir funcionalização de moléculas biológicas como a proteínas, peptídeos entre outros. Assim, o objetivo desta dissertação é desenvolver nanopartículas de ouro transportadoras do agente de contraste à base de Gd com o direcionamento ativo, por meio da proteína do fator de crescimento epidérmico. Este nanocontraste foi sintetizado utilizando a química via carbodiimida para diagnóstico precoce câncer de mama, sendo caracterizado pelas análises de Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier, Espectroscopia no UV-visível e Espalhamento Dinâmico de Luz. Os resultados indicaram que o nanocontraste apresentou um diâmetro médio de 43 nm com boa estabilidade coloidal, a eficiência do nanocontraste para diagnóstico do câncer de mama foi determinado pela intensidade relativa de sinal produzida em uma região de interesse em comparação ao contraste comercial. Embora, o nanocontraste tenha mostrado uma intensidade de sinal inferior ao comercial, é importante ressaltar que o mesmo possui uma molécula alvo para o direcionamento o que permitirá uma maior sensibilidade e especificidade para diagnóstico precoce do câncer. A viabilidade celular e atividade mitocondrial em linhagem celular MDA-MB-468, exibiu excelente biocompatibilidade e seletividade do nanocontraste, bem como baixa citotoxicidade, o que evidência grande potencial para aplicações em diagnóstico.
Nanopartículas de prata funcionalizadas ao complexo vancomicina-cisteamina para tratamento de Staphylococcus Aureus e Enterococcus Faecalis
(2022-03-08) Veriato, Thaís da Silva; Castilho, Maiara Lima; Raniero, Leandro José; Tada, Dayane Batista; Ferreira-Strixino, Juliana; São José dos Campos
Atualmente, a resistência bacteriana é um dos maiores desafios de saúde pública do século XXI. As bactérias como Staphylococcus aureus (S. aureus) e Enterococcus faecalis (E. faecalis) destacam-se a nível internacional quanto aos isolados, sendo que cerca de 30% são de S. aureus e 19,5% de E. faecalis comumente relacionadas às infecções nosocomiais. Esses microrganismos apresentam outro aspecto em comum, a resistência à vancomicina, um antimicrobiano inibidor da produção de peptidoglicano da parede celular. Nos últimos anos, em virtude desta resistência houve um aumento na demanda de novos fármacos para cessar este problema. Neste âmbito, as nanopartículas de prata (AgNPs) destacam-se pela ação antibacteriana, baixa toxicidade em sistemas biológicos e a possibilidade de associação com antibióticos a fim de aumentar o efeito no combate destes microrganismos. Neste contexto, o presente projeto teve como objetivo a funcionalização da vancomicina na superfície das AgNPs com intuito de aumentar o efeito antibacteriano no tratamento da cepas planctônicas de S. aureus e E. faecalis. Neste estudo foi possível a modificação química da vancomicina por meio da química carbodiimida. As AgNPs sintetizadas apresentaram um diâmetro hidrodinâmico de 43,82 nm e uma banda de ressonância plasmônica centrada em 392 nm, enquanto o nanofármaco Ag@vancomicina demonstrou um diâmetro de 47,28 nm e uma banda centrada em 391 nm. Nos ensaios microbiológicos de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) com a Ag@vancomicina foi possível obter uma CIM de 0,25 µg/mL para S. aureus ATCC (29213), o que representou uma redução 8 vezes da concentração. Entretanto, para as clínicas SA-1 e SA-2, a CIM manteve-se a mesma do fármaco sozinho. Porém, a SA-3 a CIM foi reduzida em 2 vezes quando comparada ao antibiótico. A cepa de E. faecalis ATCC (29212) determinou a CIM em 0,12 µg/mL, correspondendo aproximadamente uma redução de 16 vezes da CIM do fármaco. Enquanto, para as cepas clínicas EF-1, EF-2 e EF-3 a redução observada da CIM correspondeu a 4, 2 e 2 vezes, respectivamente. A CBM foi de 1 µg/mL de Ag@vancomicina para ambas as espécies ATCC. Entretanto nas clínicas o efeito bactericida em concentrações baixas só foi observado para SA-1 e SA-2, para as demais CBM é maior que 4 µg/mL. Os resultados destes ensaios exibiram um excelente desempenho do nanofármaco sintetizado, o que indica que a funcionalização potencializa a ação bacteriostática tanto das AgNPs quanto da vancomicina. Porém, para exercer a ação bactericida a concentração deve ser aumentada para determinadas cepas clínicas. Portanto, sugere-se que a Ag@vancomicina tem grande potencial para as aplicações em cepas resistentes a este antibiótico
Obtenção de lipídios por rompimento de membrana celular usando plasma não-térmico: uma abordagem alternativa para produção sustentável de lipídios
(2024-08-02) Oliveira, Virgínia Klausner de; Castilho, Maiara Lima; Contini, Rita de Cássia Mendonça Sales; Cordeiro, Thainá Barbosa de Lima; Vieira, Lúcia; São José dos Campos
Leveduras oleaginosas têm se destacado como produtoras de lipídios de interesse industrial como fonte alternativa de produção de lipídios devido à necessidade de reduzir a dependência de recursos fósseis e promover o desenvolvimento de bioprodutos renováveis. Rhodosporidium toruloides (Rt) é uma levedura oleaginosa promissora porque pode acumular grandes quantidades de lipídios neutros intracelulares. Esses lipídios têm valor comercial em diversos setores, incluindo biocombustíveis, produção de alimentos, produtos químicos e farmacêuticos. Nesta dissertação, foram estudados o rendimento da Rt e o rompimento da parede celular para posterior extração lipídica. A ruptura da parede celular foi realizada de duas formas: via plasma não térmico e extração direta do óleo por meios químicos. A morfologia celular foi analisada por microscopia eletrônica de varredura (MEV) antes e depois da ruptura da parede celular por aplicação de plasma não-térmico. As análises do óleo foram realizadas após ruptura da parede celular por meio de espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), e cromatografia gasosa com detector de ionização de chama (CG-FID). O resultado de CG-FID de ambas as vias de rompimento da membrana celular apresentam maior porcentagem de ácido palmítico e ácido oleico e seus derivados, a diferença pode ser notada na quantidade desses ácidos graxos presentes em cada amostra, com tratamento a plasma é possível observar valor elevado da concentração de ácido palmítico em detrimento do tratamento com ácido. O tratamento com plasma não-térmico mostrou-se eficiente na quebra com período de exposição de 5 minutos, e o óleo extraído fica sólido à temperatura ambiente, em torno de 24 °C. Com a técnica de MEV foi possível observar a morfologia e os danos causados à parede celular do o Rt, com espectros de FTIR confirmando a presença de ácido palmítico e ácido oleico na composição dos lipídios extraídos. Por fim, as duas amostras de óleo extraídas, com rompimento via plasma e via ácido, por solventes químicos foram testadas como lubrificante entre um par tribológico de esfera e placa de aço 316L em atmosfera ambiente em uma trilha de 1 mm com força normal de 5N e frequência de 1Hz. Neste contexto, os resultados indicaram uma redução mais significativa no coeficiente de atrito para o óleo obtido via plasma não-térmico. A composição química deste óleo foi analisada para melhor elucidar os resultados obtidos.
Síntese de nanopartículas de prata funcionalizadas com amicacina aplicadas contra cepas resistentes de Acinetobacter baumannii
(2021-12-07) Camargo, Larissa de Oliveira; Castilho, Maiara Lima; Raniero, Leandro José; Silva, Newton Soares da; Oliveira, Luciane Dias de; São José dos Campos
A humanidade se depara com um dos maiores problemas de saúde após décadas de terapia bem-sucedida de acordo com a Organização Mundial da Saúde: bactérias multidrogas resistentes. Dessa maneira, inúmeras pesquisas têm sido realizadas com a intenção de melhorar o espectro de ação dos agentes antimicrobianos existentes e ainda, desenvolver novos fármacos. Há duas substâncias antibacterianas bastante conhecidas, os sais de prata usados desde a Antiguidade e a amicacina, um aminoglicosídeo desenvolvido nos anos 70 com potente atividade contra microrganismos Gram-negativos. Entretanto, devido aos mecanismos evolutivos bacterianos, ambas as drogas perderam a eficácia contra algumas bactérias como Acinetobacter baumannii, um bacilo Gram-negativo nosocomial que pode ser letal em pacientes imunologicamente comprometidos. Objetivando reverter essa problemática, esta pesquisa prevê o desenvolvimento de um nanofármaco a partir de nanopartículas de prata funcionalizadas ao antibiótico amicacina e a avaliação do seu potencial bactericida/bacteriostático contra cepas resistentes de Acinetobacter baumannii. As nanopartículas de prata (AgNPs) foram sintetizadas por meio da redução química entre nitrato de prata e borohidreto de sódio, sendo caracterizadas por espectroscopia UV-Visível na faixa entre 380-400 nm e pelo espalhamento dinâmico de luz. A reação química da carbodiimida foi utilizada para a modificação da amicacina a fim de introduzir grupos dissulfetos no fármaco favorecendo a ligação com as nanopartículas, formando o nanofármaco. A caracterização do processo de modificação do fármaco foi confirmada pela observação dos grupos funcionais moleculares por espectroscopia no infravermelho. Os testes de suscetibilidade como concentração inibitória mínima determinada pela técnica de microdiluição em caldo e concentração bactericida mínima foram realizados de acordo com a padronização internacional ISO 20776-1 usando quatro cepas clínicas de Acinetobacter baumannii multidroga resistentes e uma cepa ATCC (19606) sensível à amicacina para avaliar o potencial bacteriostático e bactericida do nanofármaco (AgNPs@Amicacina) desenvolvido. As AgNPs sintetizadas apresentaram um diâmetro hidrodinâmico de aproximadamente 37nm com uma distribuição bimodal e boa estabilidade química. A conjugação da amicacina com a nanopartícula de prata foi efetiva apresentando bandas de absorção especificas caracterizando o nanofármaco sintetizado. Os testes de susceptibilidade mostram uma grande eficácia das AgNPs@Amicacina contra cepas resistentes de Acinetobacter baumannii apresentando uma concentração bactericida e bacteriostática de 0,5 µg/mL. Esses estudos demonstram dados promissores para o desenvolvimento de um novo antimicrobiano com dosagens mais baixas de aminoglicosídeos, menores efeitos adversos e maior eficácia aplicados em cepas com perfil multidrogas resistentes

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